切换至 "中华医学电子期刊资源库"
高级检索
中华医学超声杂志（电子版）

中华医学超声杂志（电子版） >

2024 , Vol. 21 >Issue 06: 608 - 616

DOI: https://doi.org/10.3877/cma.j.issn.1672-6448.2024.06.010

基础研究

NBAV脂质纳泡对ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化病变的评估和干预

  • 马晓菊 1 ,
  • 梁潇 2 ,
  • 段云友 2 ,
  • 袁丽君 2 ,
  • 赵萍 , 2, †
展开
  • 1.710038　西安，空军军医大学唐都医院超声科；710600　西安，临潼康复疗养中心健康管理部特诊科
  • 2.710038　西安，空军军医大学唐都医院超声科
通信作者：赵萍，Email：

Copy editor: 汪荣

收稿日期: 2024-04-09

  网络出版日期: 2024-08-05

基金资助

唐都医院社会人才项目(2021SHRC014)

陕西省自然科学基金项目(2022JQ-835)

版权

未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计，除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。本刊为电子期刊，以网刊形式出版。
收起

Eualuation and intervention of annexin V nanobubbles on atherosclerotic lesions in ApoE -/- mice

  • Xiaoju Ma 1 ,
  • Xiao Liang 2 ,
  • Yunyou Duan 2 ,
  • Lijun Yuan 2 ,
  • Ping Zhao , 2, †
Expand
  • 1.Department of Ultrasonic Medicine, Tangdu Hospital, Air force Medical University, Xi’an 710038, China; Ultrasonic Department, Lin Tong Rehabilitation and Convalescent Center, Xi’an 710600, China
  • 2.Department of Ultrasonic Medicine, Tangdu Hospital, Air force Medical University, Xi’an 710038, China
Corresponding author: Zhao Ping, Email:

Received date: 2024-04-09

  Online published: 2024-08-05

Copyright

Copyright by Chinese Medical Association No content published by the journals of Chinese Medical Association may be reproduced or abridged without authorization. Please do not use or copy the layout and design of the journals without permission. All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.
Fold

摘要

目的

应用膜联蛋白AV脂质纳泡（AV-Nanobubbles，NBAV）评估ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）病变并分析其对斑块内组织因子（tissue factor，TF）表达和血脂水平的影响，探讨NBAV评估、干预AS斑块及抗凝、抗血栓的潜在价值。

方法

以高脂饲料喂养雄性ApoE -/-小鼠8~10周建立AS斑块模型鼠50只，对照组C57小鼠10只。高频超声、血管解剖及离体动脉油红O染色观察建模效果；NBAV超声造影成像观察模型鼠AS斑块特征；HE、Masson、油红O及TUNEL染色分析斑块性质。将模型鼠随机分为治疗组（n=20）和未治疗组（n=20），分别经尾静脉注射NBAV稀释液150 μl（50 μl/10g）及等量生理盐水，每5天1次，共8周。以二维超声动态观察不同治疗时间小鼠AS斑块变化情况，并取血管标本行组织学染色分析斑块内TF含量；另收集治疗后小鼠血液标本，检测血脂各项指标的变化。

结果

高脂饮食喂养8周后，高频超声可探及ApoE -/-小鼠AS斑块回声，镜下及油红O染色显示脂肪类物质附着于血管壁。超声造影显示，相对于NBctrl（未结合AV），注射NBAV后60、120、180 s时，斑块内回声强度差异均有统计学意义[60 s：（106.33±23.0）dB vs （62.33±18.5）dB，120 s：（101.33±17.3）dB vs （41.67±10.3） dB，180s：（72.67±10.2）dB vs（22.00±5.2）dB，P均<0.01]。注射NBAV后出现高增强且持续时间长的模型鼠AS斑块，对应组织病理学检测结果显示，管壁结构不规则、排列紊乱，斑块内大量脂质积聚、蓝染的胶原纤维减少，且斑块内Tunel阳性染色区（凋亡细胞）增加，显示易损性斑块特征。NBAV连续治疗6周后，斑块区TF表达降低，与治疗0周和2周相比，TF表达的差异有统计学意义（t=14.17，P<0.001；t=7.022，P<0.01）。至第8周时，治疗组模型鼠的血脂指标甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平显著低于未治疗组（P均<0.05），高密度脂蛋白胆固醇水平则高于未治疗组（P<0.05）。

结论

NBAV具有评估AS斑块易损性，降低斑块内TF表达以及改善AS血脂的作用，NBAV对AS病变干预有潜在价值。

关键词： 动脉粥样硬化斑块; 组织因子; 膜联蛋白AV; 超声造影; 脂质纳泡

本文引用格式

马晓菊 , 梁潇 , 段云友 , 袁丽君 , 赵萍 . NBAV脂质纳泡对ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化病变的评估和干预[J]. 中华医学超声杂志（电子版）, 2024 , 21(06) : 608 -616 . DOI: 10.3877/cma.j.issn.1672-6448.2024.06.010

Abstract

Objective

To investigate the effect of annexin V conjugated nanobubbles (NBAV) on atherosclerotic (AS) lesions, tissue factor (TF) expression in atherosclerotic plaques, and lipid levels in ApoE -/- mice, and explore the potential value of NBAV in plaque intervention, as well as their anti-thrombotic effects.

Methods

ApoE -/- mice (n=50) were fed a high fat for 8~10 weeks to establish an atherosclerotic plaque model, and normal C57 mice (n=10) were uesed as controls. The characterization of plaques was performed by high-frequency ultrasound, microanatomy, and oil red O staining. In vivo contrast-enhanced ultrasound (CEUS) was then performed on AS plaques in ApoE -/- mice with NBAV and NBCtrl injection. After CEUS, the plaques were histopathologically assessed in vitro by hematoxylin-eosin, Masson, oil red O, and TUNEL staining. Model mice were randomly divided into a nontreatment group (n=20) and a treatment group (n=20). The treatment group was injected with 150 μl of NBAV dilution (50 μl/10 g) via the tail vein every 5 days for 8 weeks. The nontreatment group was given the same amount of normal saline. After several weeks of treatment, blood vessel samples were collected for analysis of TF expression and blood samples were collected for blood lipid analysis.

Results

After 8 weeks of high fat feeding, ApoE -/- mice showed echo-enhanced atherosclerotic plaques, as revealed by microscopic findings and oil red O staining. Compared with mice injected with NBCtrl, in vivo CEUS showed that there was strong and sustained echo enhancement in plaque area of the aortic arch in mice with NBAV injection [60 s: (106.33±23.0) dB vs (62.33±18.5) dB; 120 s: (101.33±17.3) dB vs (41.67±10.3) dB; 180 s: (72.67±10.2) dB vs (22.00±5.2) dB, P < 0.01]. Further histopathological results showed that plaques in mice with NBAV injection presented significant pathological changes with vulnerable features and abundant TUNEL-positive area, such as irregular morphology, disordered arrangement of the vessel wall, a large amount of lipid accumulation, and a decrease in blue-dyed collagen fibers in the plaque. The positive TF staining areas in plaques began to decrease after 6 weeks of NBAV treatment, and TF expression was significantly different compared with that at 0 and 2 weeks of NBAV treatment (t =14.17, P < 0.001; t =7.022, P < 0.01). The levels of TG, TC, and LDL-c were significantly lower in mice treated with NBAV for 8 weeks than in nontreatment group (P < 0.05), while the level of HDL-c was significantly higher than that of the nontreatment group (P < 0.05).

Conclusion

NBAV can be used to evaluate AS plaque vulnerability and reduce TF expression within plaques and blood lipids, suggesting that NBAV have potential value in intervening in AS lesions.

Key words： Atherosclerosis plaque; Tissue factor; Annexin V; Contrast-enhanced ultrasound; Lipid nanobubbles

大量研究表明，急性心血管事件的发生与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）斑块破裂直接相关[1]。早期评估AS病变程度及斑块的易损性对于此类事件的风险预测及预防有积极作用。AS以多种危险因素致血管内皮受损及功能紊乱为起始，进而引发脂质在受损部位局部沉积，逐渐形成AS斑块。研究已证实，受损的血管内皮及易损斑块均表达较高浓度的组织因子（tissue factor，TF）[2]，易触发血栓形成[3]。氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）可诱导单核细胞/巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等多种细胞表达TF[4]。
细胞凋亡是AS斑块病变进程中的关键细胞事件。一项新的研究表明，细胞凋亡（特别是巨噬细胞和平滑肌细胞凋亡）与晚期病变中斑块易损程度显著相关[5,6]。斑块脂质核内富含的凋亡脱落膜微粒是TF最主要的激活剂[7]，参与并加速易损斑块不良事件的发生，同时含有凋亡和TF的微粒促凝活性最高。因此，靶向干预细胞凋亡可能对调控TF活化状态、发挥抗凝作用至关重要。
前期研究发现，靶向细胞凋亡的膜联蛋白V（annexin V，AV）脂质纳泡（AV-nanobubbles，NBAV）对ox-LDL体外诱导巨噬细胞表达的TF具有显著抑制作用[8]。基于此，本研究拟以超声成像分析NBAV评估载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除（ApoE -/-）小鼠AS病变的作用，并进一步探讨NBAV在动物水平调控TF及血脂水平的效果，为深入挖掘NBAV在干预AS斑块进展及抗凝、抗血栓中的作用研究奠定基础。

材料与方法

一、主要试剂与仪器

1．主要试剂：

二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC，Sigma公司）；生物素化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（Bio-DSPE-PEG2000，Avanti公司）；亲和素（Invitrogen公司）；生物素化Annexin V（Biovision公司）；0.01 mol/L的PBS缓冲液、生理盐水、二硝基亚砜、4%多聚甲醛/通用型组织固定液、OCT包埋剂（商品化购买）；HE染液、Masson染液、油红染液、苏木素染液、柠檬酸（pH6.0）抗原修复液、抗荧光淬灭封片剂、组化试剂盒DAB显色剂（武汉谷歌生物）；抗兔HRP标记的二抗、组织因子一抗（兔源多克隆抗体，Cell Signaling）；高脂高胆固醇饮食（MD12015饲料，含21%乳脂和0.15%的胆固醇，江苏Medicinence, Ltd.）；TUNEL染色试剂盒（罗氏诊断公司）。

2．仪器：

荧光显微镜（Olympus）；全自动生化分析仪（深圳雷杜）；酶标仪（Thermo）；激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss, Oberkirchen）；智能化一体型正置显微镜-DM750（德国徕卡公司）；高分辨率小动物彩色超声成像系统（Vevo2100，Visualsonics）。

二、方法

1．ApoE -/-小鼠AS斑块模型建立：

50只实验用ApoE -/-小鼠[SPF级，雄性，6~8周龄，体重（24.82±0.26）g]购自维通利华实验动物技术有限公司，编号后置于（20±2）℃、45%相对湿度和每日12/12光/暗循环分笼喂养。普通饮食一周后，给予高脂高胆固醇饮食喂养。给予相同饮食的10只C57小鼠作为对照。所有动物护理和实验方案均经空军军医大学实验动物护理和使用委员会批准[SCXK（陕）2019-001]，且符合《NIH实验动物的护理和使用指南》。

2．超声成像观察ApoE -/-小鼠AS斑块：

采用MS 400超声探头（频率范围为18~38 MHz），高脂饮食喂养开始后每两周观察一次小鼠动脉。具体流程：2%异氟烷吸入麻醉小鼠，成像期间1.5%异氟烷维持（心率360~420次/min、呼吸曲线平稳），同时使用压力传感器监测呼吸信号以调节麻醉深度。麻醉后小鼠仰卧位固定于恒温板上，暴露成像区域（小鼠颈部至下腹部、两侧至侧腹部），优化超声参数至最佳成像效果。经胸从主动脉根部起多切面依次扫查主动脉及颈动脉，观察动脉内中膜厚度及回声强度，有无斑块、斑块形态及回声。在舒张末期测量内中膜厚度及斑块大小，保留图像。选取动脉血管斑块最佳成像位置，确定为感兴趣区。成像结束将小鼠回笼继续给予高脂高胆固醇饮食喂养。

3．一体式解剖显微镜观察ApoE -/-小鼠AS斑块：

高脂饮食8周后，随机取AS模型鼠及C57小鼠各3只，腹腔注射150 μl浓度为4%的戊巴比妥钠溶液，深度麻醉下拖颈处死。小鼠仰卧位置于智能化一体式解剖显微镜下固定四肢及头颈部，沿腹正中线切开皮肤、软组织及部分肋骨，充分暴露颈动脉、主动脉及髂动脉区域。用眼科显微解剖器械仔细去除主动脉周围的脂肪和结缔组织，将主动脉从根部分离到髂动脉分叉处远端，并仔细分离颈部动脉分支，镜下观察整个主动脉及其颈部动脉分支，数码相机拍照。ImageJ软件分析血管壁脂肪样内容物附着面积占血管总面积的比例。

4．大体油红O染色分析ApoE -/-小鼠AS斑块：

将上述处死后小鼠的主动脉（主要包括部分颈动脉及髂动脉）分离。大体油红O染色定量动脉壁中的脂质积累，流程如下：从组织固定液中取出小鼠离体主动脉，PBS浸洗两次后在显微镜下沿血管壁纵向切开，浸入60%的异丙醇3 s后置于油红O染液中避光染色60 min。60%异丙醇中分化，至管腔内脂质区呈橘红色或鲜红色，取出血管拍照。ImageJ软件分析红染区面积占血管总面积的比例。

5．NBAV脂质纳泡超声造影成像评估AS斑块特征：

NBAV按照前期研究方法制备[8]，电镜下观察其形态特征，纳米粒径分析仪检测NBAV大小。随机选取6只AS模型鼠，麻醉后于二维超声成像模式下先选取动脉斑块最佳成像位置，然后给予尾静脉注射适量NBAV（50 μl/10 g），选用MS 250型超声探头（频率13~24 MHz）在超声造影模式下进行成像，预先设置成像参数至最佳（机械指数0.065，对比度增益38 dB，动态范围35 dB，深度20 mm），持续观察5 min。24 h后，待NBAV在小鼠体内代谢后，再给予等量对照脂质纳泡（未结合AV的NBCtrl）后超声造影观察相同位置感兴趣区AS斑块成像，成像参数同上。依据不同鼠斑块的造影回声及成像差异，将其纳入NBAV敏感组与不敏感组，用于后续实验。

6．组织学指标及TUNEL染色观察AS斑块性质：

随机选取6只C57小鼠与上述经超声造影成像实验后的6只AS模型鼠，一并处死，取与造影成像相对应的感兴趣区动脉节段分别制作石蜡切片和冰冻切片。选择石蜡切片厚度为5 μm，随后按照HE及Masson染色步骤处理后，对切片进行脱水封片，拍照存图。另将选取的标本制备成冰冻切片，复温干燥后固定、晾干，油红O染液避光浸染，60%异丙醇分化，纯水浸洗，苏木素复染，封片或镜检。最后取部分冰冻切片以TUNEL染色步骤处理后，激光共聚焦显微镜观察存图，ImageJ软件分析。

7．NBAV治疗小鼠AS病变：

选取40只ApoE -/-模型鼠，随机分为治疗组（n=20）与非治疗组（n=20）。治疗组经尾静脉注射适量脂质纳泡NBAV（50 μl/10 g），每5天治疗一次。非治疗组给予等量生理盐水。为了保证操作的稳定性，实验在红外尾静脉辅助注射装置下操作。注射前，先将小鼠固定，然后将提前准备好的NBAV稀释液按体重缓慢注射小鼠体内。

8．超声动态观测NBAV治疗后AS斑块变化：

随机选取治疗0、2、6和8周的模型鼠各3只，超声观察各组小鼠AS斑块的形态大小及回声强度变化情况，选择主动脉短轴切面为扫查切面，留图，操作流程和成像参数同前。

9．免疫组化分析NBAV治疗后斑块内TF的含量变化：

上述超声观察结束后，深度麻醉小鼠后断颈处死，取血管标本于4%多聚甲醛组织固定液中固定至少24 h。将近端主动脉及颈动脉相对应节段脱水并包埋于石蜡中，制备切片（厚度5 μm），石蜡切片经血清封闭后，加一定稀释比例的一抗（TF，1:50），二抗，DAB显色，苏木素复染细胞核，最后脱水封片，镜下观察，图像采集分析。

10．血脂分析：

根据TF的分析结果，随机选取NBAV治疗一定周期的小鼠与非治疗组模型鼠各5只，给予深度麻醉后摘除眼球，收集血液标本（每只小鼠1.0~1.5 ml），于4℃下离心15 min（3000 r/min），收集血清样本，Chemray 800全自动生化分析仪检测甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-c）以及高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）含量并分析。

三、统计学分析

采用Graphpad Prism 8.0进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用±s表示。2组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、AS斑块模型建立及验证

高脂高胆固醇饮食喂养8周后，二维超声探查ApoE -/-小鼠（n=3）主动脉短轴切面图像，可见血管壁局部增厚，管腔内强回声或稍强回声突起（图1a）。对照C57小鼠（n=3）动脉管腔呈无回声，内膜光滑（图1b）。解剖显微镜下观察，高脂饮食喂养的ApoE -/-小鼠动脉壁可见多发乳白色脂肪样内容物附着（图1c），定量分析其与血管总面积百分比，与对照组相比差异有统计学意义[（48.23±1.58）% vs （4.76±0.43）%，t=26.57，P < 0.0001]。离体动脉大体油红O染色结果示，高脂喂养组ApoE -/-小鼠主动脉及其分支可见大量红染的阳性脂质分布（图1d），与对照组C57小鼠对比，差异有统计学意义[（56.67±1.62）% vs （9.17±0.61）%，t=28.05，P < 0.0001]。
图1 ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化斑块模型二维超声图像、解剖形态及大体油红O染色图像。图a，b为二维超声模式观察主动脉短轴切面（图a为对照C57鼠，图b为模型鼠，红色箭头示斑块位置）；图c为解剖显微镜下观察C57小鼠和ApoE -/-小鼠动脉病理解剖形态（左图为对照C57鼠，右图为模型鼠）；图d为血管油红O染色图像，斑块中沉积的脂质被染色成红色（上图为对照C57鼠，下图为模型鼠）

二、ApoE -/-小鼠AS斑块的靶向超声造影增强成像

电镜下NBAV形态均一，与纳米粒径分析仪检测结果基本一致，约（538 ±21.6）nm，多分散指数（polydispersity index，PDI）为0.807（图2）。超声造影选择主动脉弓短轴和头臂干长轴切面为感兴趣区，注射NBAV、NBCtrl脂质纳泡后10 s，感兴趣区斑块内回声强度差异无统计学意义（P > 0.05），注射NBAV后60 s和120 s时，可见斑块内尚有较强回声，而注射NBCtrl后60 s和120 s的回声强度稍有减弱，差异有统计学意义[（60 s：（106.33±23.0）dB vs （62.33±18.5）dB，P < 0.01；120 s：（101.33±17.3）dBvs （41.67±10.3）dB，P < 0.01]，注射NBAV后180 s时斑块区仍有强回声，而注射NBCtrl后180 s时强回声几乎消失，回声强度相比差异有统计学意义[（72.67±10.2）dB vs （22.00±5.2）dB，P < 0.01，图3、图4]。为了矫正和排除血管内回声的干扰，将NBAV、NBCtrl脂质纳泡注射后60、120、180 s感兴趣区斑块回声与血管腔内回声强度的比值进行比较，结果显示差异均有统计学意义（P均 < 0.05，图5）。根据分析结果，将NBAV造影呈高增强、持续时间长（回声强度和持续时间与NBctrl成像差异有统计学意义）的斑块纳入NBAV敏感组，反之，则纳入NBAV不敏感组。
图2 NBAV脂质纳泡电镜下图像及纳米粒径分析仪检测结果。图a显示电镜下NBAV形态均一；图b为纳米粒径分析仪检测结果，粒径大小约（538±21.6）nm
图3 注射NBAV、NBCtrl脂质纳泡后不同时间点斑块内回声强度超声造影图像。图a~d为注射NBCtrl后10、60、120、180 s超声造影增强图像；图e~h为注射NBAV后10、60、120、180 s超声造影增强图像

注：白色虚线圆圈为动脉粥样硬化病变感兴趣区域

图4 6只ApoE -/-小鼠注射NBAV、NBCtrl脂质纳泡后不同时间点感兴趣区斑块内回声强度比较折线图

注：**表示P<0.01

图5 6只ApoE -/-小鼠NBAV、NBCtrl脂质纳泡注射后不同时间点感兴趣区斑块与血管腔内回声强度的比值柱状图

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001

三、体外组织病理学染色结果

HE染色、油红O染色和Masson染色结果显示，与C57小鼠（n=6）动脉血管壁结构对比，模型鼠（n=6）动脉管壁形态不规则，排列较紊乱，管腔内可见突出的斑块样结构，且模型鼠中NBAV敏感组斑块内可见大量空泡状脂肪组织，油红O阳性染色区显著增加，斑块内蓝染的胶原纤维明显减少且着色浅，提示其内脂质积聚多，斑块易损性特征显著（图6）。TUNEL染色结果显示，模型鼠中NBAV敏感组斑块内凋亡阳性率显著高于C57小鼠（0.47±0.07 vs 0.03±0.00），且差异具有统计学意义（t=5.973，P < 0.01，图7）。
图6 小鼠动脉血管离体组织病理学染色结果。图a~c为C57小鼠的HE、油红O染色和Masson染色图像；图d~f为模型鼠的HE染色、油红O染色和Masson染色图像
图7 小鼠动脉血管离体组织TUNEL染色图像。图a~c为C57小鼠DAPI染色、TUNEL染色及组合染色图像；图d~f为模型鼠中NBAV敏感组DAPI染色、TUNEL染色及组合染色图像

四、NBAV治疗后ApoE -/-小鼠AS斑块的超声表现及对TF表达的影响

二维超声图像下不同治疗时间后，AS斑块的形态、回声强度及大小无明显变化（图8）。治疗后斑块内的TF阳性染色区呈现逐渐减少趋势，斑块内大的脂质核区逐渐缩小（图9）；与治疗0周和2周相比，治疗6周时小鼠AS斑块内TF的差异有统计学意义（t=14.17，P < 0.001；t=7.022，P < 0.01），至第8周时，斑块内TF表达稳定在较低水平（图10）。
图8 NBAV治疗后ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化斑块的二维超声表现。图a~d分别为治疗0、2、6、8周二维超声主动脉短轴切面观察小鼠动脉粥样硬化斑块的形态及回声情况
图9 免疫组化分析NBAV对动脉粥样硬化斑块内组织因子（TF）表达的影响。图a~d分别为治疗0、2、6、8周TF免疫组化图像（红色箭头示TF阳性染色区）
图10 NBAV治疗后ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化斑块内组织因子（TF）表达的定量分析（治疗0~8周不同时间段各取3只小鼠进行观察）

注：TF为组织因子；OD为光密度值；*表示P < 0.05；**表示P < 0.01

五、ApoE -/-小鼠血脂生化指标

NBAV治疗8周后，与非治疗组模型鼠相比，治疗组TG、TC和LDL-c水平显著降低（P均<0.05），HLD-c高于非治疗组（P<0.05，表1）。
表1 NBAV治疗组与非治疗组ApoE -/-模型鼠血脂生化指标比较（±s，mmol/L）
组别 数量（只） TG TC LDL-c HDL-c
非治疗组 5 3.592±0.23 17.64±0.63 13.41±1.64 1.457±0.15
治疗组 5 1.250±0.09 12.79±0.88 7.631±0.55 2.421±0.02
t值   9.474 4.472 4.292 6.399
P值   0.011 0.046 0.013 0.003

注：TG为甘油三酯；TC为总胆固醇；LDL-c为低密度脂蛋白胆固醇；HDL-c为高密度脂蛋白胆固醇

讨论

目前，AS稳定斑块转变为临床显著发病斑块（易损性斑块）可能涉及多种生物学过程复杂的相互作用，如炎症、基质重塑、血管生成和细胞凋亡等[9]。其中，细胞凋亡在斑块进展中发挥重要作用，大量凋亡细胞积累是晚期AS斑块的一个突出特征[10]，细胞凋亡已被证实在快速进展斑块患者的诊断和治疗策略中有潜在价值[10,11]。
TF是细胞膜上的一种跨膜糖蛋白[12]，具有促凝作用。生理条件下，TF以不活跃的"加密型"存在，血管内皮细胞及单核细胞上不表达或低表达TF。当内皮功能受损时，如LDL-c负荷或炎症条件等刺激下，TF被诱导转化为活性增加的"解密型"状态[13]，单核细胞和血管内皮细胞高表达TF[2,14]。局部暴露于血液中的活性TF为凝血因子FⅦ/FⅦa在细胞表面的受体和协同因子[15]，二者结合激活凝血级联反应，最终导致急性血管内血栓形成。
临床研究发现，冠状动脉切除术后的患者，其离体的AS斑块标本中检测到高水平的TF抗原[16]，且不稳定型斑块坏死核心中含量更高。他汀类药物对降低单核细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞中TF的表达有积极作用[17,18]，但不同细胞类型来源的TF对AS进展的贡献程度尚未阐明[2]，抑制TF的效果可能也有差异。组织因子途径抑制剂（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）是一种选择性剪接的抗凝蛋白，其作用仅限于表达TF的细胞和损伤部位。因此，急需开发一种有效手段对AS斑块内的TF活性进行整体干预。
研究已证实细胞凋亡与斑块进展显著相关[10]，晚期AS病变中的易损性斑块内凋亡细胞（主要为巨噬细胞）及其表面的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）含量极高[11,19]。有研究表明，凋亡分子探针AV以高亲和力结合PS后形成的二聚体结构具有抗炎及抗凝的作用[20]。前期，课题组以AV为分子探针制备了一种靶向凋亡细胞的脂质纳泡NBAV，细胞实验证实荧光标记后的NBAV可靶向结合ox-LDL诱导的凋亡巨噬细胞，发挥抑制TF表达的作用[8]。本研究中，进一步在动物水平分析了超声靶向脂质纳泡NBAV评估AS易损斑块的作用。超声造影成像及组织病理学结果均表明，被NBAV靶向显影的斑块易损斑块特征显著，TUNEL染色细胞（凋亡细胞）阳性率也更高，表明NBAV敏感组斑块内回声持续高增强可能与凋亡细胞含量正相关，NBAV可作为评价AS病变内凋亡细胞和易损斑块特性的敏感探针。针对NBAV的初步治疗结果表明，连续治疗6周时，斑块内的TF阳性染色区域逐渐减少，斑块内大的脂质核心区开始逐渐减小。NBAV治疗8周后，TG、TC和LDL-c水平显著低于未治疗组，HDL-c水平显著高于未治疗组，以上结果表明NBAV治疗对降低TF表达和改善血脂有积极作用，有望为后期深入挖掘NBAV诊疗一体化功能，提升干预AS病变的效果提供依据。值得注意的是，本研究制备的NBAV为单靶点纳泡，对斑块内发生凋亡的细胞敏感，但对于这些凋亡细胞中的巨噬细胞、平滑肌细胞等凋亡率占比的评价未进一步研究。后期还需设计更加特异的，能针对特定类型细胞凋亡进行评级的双靶或者多靶纳泡用于更加精细地区分。
从病理生理学层面看，稳定甚至逆转斑块是动脉粥样硬化性心血管疾病的终极治疗目标[21]。最新指南及专家共识指出，作为血脂干预的首要靶点，强化降低LDL-c至目标值对斑块稳定抑或是逆转有利[21,22]。本研究中，二维超声图像尚未观察到治疗后斑块大小的明显改变，考虑可能与血脂尤其是LDL-c尚未降到目标低值有关。本研究中，治疗8周后血脂指标发生改变，而TF水平的降低则发生在NBAV治疗6周时，那么TF的降低对随后的血脂指标改善是否有影响，以及治疗后TF降低是否能够改变斑块特性，促进斑块向着非易损性特征转变，这些可能的作用以及具体的机制还需要深入研究。
综上所述，NBAV具有评估AS病变、诊断斑块易损性，以及降低斑块内TF表达和改善AS血脂的作用，对AS病变干预有潜在价值。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
1
Meng H, Ruan J, Yan Z, et al. New progress in early diagnosis of atherosclerosis [J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(16): 8939.

2
Grover SP, Mackman N. Tissue factor in atherosclerosis and atherothrombosis [J]. Atherosclerosis, 2020, 307: 80-86.

3
Grover SP, Mackman N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2018, 38(4): 709-725.

4
Cimmino G, Cirillo P, Conte S, et al. Oxidized low-density lipoproteins induce tissue factor expression in T-lymphocytes via activation of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1[J]. Cardiovasc Res, 2020, 116(6): 1125-1135.

5
Simion V, Zhou H, Haemmig S, et al. A macrophage-specific lncRNA regulates apoptosis and atherosclerosis by tethering HuR in the nucleus[J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 6135.

6
Edsfeldt A, Stenström KE, Sun J, et al. Human atherosclerotic plaque progression is dependent on apoptosis according to Bomb-Pulse (14)C dating[J]. JACC Basic Transl Sci, 2021, 6(9-10): 734-745.

7
Spronk HM, ten Cate H, van der Meijden PE. Differential roles of tissue factor and phosphatidylserine in activation of coagulation[J]. Thromb Res, 2014, 133 Suppl 1: S54-S56.

8
赵萍, 马晓菊, 陈建梅, 等. 膜联蛋白V纳米微泡抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞组织因子表达的实验研究[J]. 中国超声医学杂志, 2021, 37(10): 1182-1185.

9
Araki M, Yonetsu T, Kurihara O, et al. Predictors of rapid plaque progression: an optical coherence tomography study [J]. JACC Cardiovasc Imaging, 2021, 14(8): 1628-1638.

10
Tawakol A, Abohashem S, Zureigat H. Imaging apoptosis in atherosclerosis: from cell death, a ray of light [J]. J Am Coll Cardiol, 2020, 76(16): 1875-1877.

11
Sinha SK, Miikeda A, Fouladian Z, et al. Local M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) expression regulates macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2021, 41(1): 220-233.

12
Manoharan J, Rana R, Kuenze G, et al. Tissue factor binds to and inhibits interferon-α receptor 1 signaling [J]. Immunity, 2024, 57(1): 68-85.

13
Oe Y, Takahashi N. Tissue factor, thrombosis, and chronic kidney disease [J]. Biomedicines, 2022, 10(11): 2737.

14
Musgrave KM, Scott J, Sendama W, et al. Tissue factor expression in monocyte subsets during human immunothrombosis, endotoxemia and sepsis [J]. Thromb Res, 2023, 228: 10-20.

15
Witkowski M, Witkowski M, Friebel J, et al. Vascular endothelial tissue factor contributes to trimethylamine N-oxide-enhanced arterial thrombosis [J]. Cardiovasc Res, 2022, 118(10): 2367-2384.

16
Ardissino D, Merlini PA, Ariëns R, et al. Tissue-factor antigen and activity in human coronary atherosclerotic plaques [J]. Lancet, 1997，349(9054): 769-771.

17
Siniscalchi C, Basaglia M, Riva M, et al. Statins effects on blood clotting: a review [J]. Cells, 2023, 12(23): 2719.

18
Rao AK, Del Carpio-Cano F, Janapati S, et al. Effects of simvastatin on tissue factor pathway of blood coagulation in STATCOPE (Simvastatin in the prevention of COPD exacerbations) trial[J]. J Thromb Haemost, 2021, 19(7): 1709-1717.

19
Shekhar A, Heeger P, Reutelingsperger C, et al. Targeted imaging for cell death in cardiovascular disorders[J]. JACC Cardiovasc Imaging, 2018, 11(3): 476-493.

20
高梦月, 黄张建, 华子春. 膜联蛋白A5在疾病诊断与新药开发中的应用前景[J]. 药学进展, 2019, 43(1): 3-11.

21
中国血脂管理指南修订联合专家委员会. 中国血脂管理指南(2023年) [J]. 中国循环杂志, 2023, 38(3): 237-271.

22
中华医学会心血管病学分会动脉粥样硬化与冠心病学组, 中华心血管病杂志编辑委员会. 超高危动脉粥样硬化性心血管疾病患者血脂管理中国专家共识[J]. 中华心血管病杂志, 2020, 48(4): 280-286.

Options
文章导航

/

〈 〉

版权所有 中华医学会 中华医学电子音像出版社有限责任公司  京ICP备14006079号-1  网络出版服务许可证：(署)网出证(京)字第075号

AI
小
编
AI小编
你好！我是《中华医学电子期刊资源库》AI小编，有什么可以帮您的吗？