肿瘤的发生发展严重影响患者的生活质量及生存时间。目前，放化疗及免疫治疗仍是肿瘤治疗的主要手段［1］。由于肿瘤血管的不成熟、不均衡生长，肿瘤内部易形成乏血供区域［2］。肿瘤内部组织间压升高致使肿瘤血管塌陷，进一步导致肿瘤乏氧状态的形成［3］。肿瘤区域乏血供乏氧微环境导致肿瘤多种治疗抵抗，化疗药物难以抵达肿瘤内部导致化疗抵抗，缺乏氧自由基导致放疗抵抗，T细胞浸润不足导致免疫治疗抵抗［2］。因此，肿瘤乏血供乏氧微环境使实体肿瘤治疗面临挑战。
近年来，Belcik等［4-5］以及Xie等［6］的研究表明，超声激励微泡空化可以增加小鼠局部肌肉以及心肌的血流灌注并且改善组织缺血，这种效应被称为“Sonoreperfusion”。本课题组前期研究发现低强度诊断超声激励微泡空化可增加乏血供肿瘤的血流灌注，即超声肿瘤血流效应［7-8］，从而有望改善缺血及放化疗抵抗［9,10,11］。而超声空化的强弱与许多参数有关，包括机械指数（mechanical index，MI）、脉冲重复频率（pulse repetition frequency，PRF）、占空比、治疗时间等。本课题组已经对其他超声参数进行了初步讨论，然而治疗时间仍依赖经验性选择。对于超声激励的空化治疗，宽泛的治疗时间选择会导致动物实验以及后期临床实践的不规范和随意性，可能会降低超声肿瘤血流效应的稳定性，并增加副作用的发生风险。因此，对于超声空化增强乏血供肿瘤血流灌注的治疗时间的研究是十分必要的。
本实验通过建立小鼠皮下MC38肿瘤模型，研究在其他参数相同的条件下，不同超声治疗时间对诊断超声激励微泡空化增强肿瘤血流灌注的影响，旨在明确能够使肿瘤血流灌注增强的最佳治疗时间，探究超声肿瘤血流效应是否会随着治疗时间的延长而增强，并对治疗相关的机制进行初步探索。
材料与方法
一、实验动物
6周龄健康雌性C57BL/6小鼠54只，体质量17~20 g，购买于北京华阜康生物科技有限公司。本实验中动物操作及处理符合陆军军医大学实验动物福利审查委员会制订的伦理学标准，批准文号［AMUWEC20226047］。
二、实验仪器与试剂
2.主要试剂：使用“脂氟显”微泡造影剂，由本实验室自制，以磷脂为外壳，内包裹全氟丙烷气体。使用前放入振荡机内振荡100 s，微泡悬浮液浓度为（4~9）×109/ml，平均粒径约为2.1 μm［16］。总一氧化氮检测试剂盒，购买于上海碧云天生物技术有限公司。
三、实验方法
1.模型建立：小鼠MC38肿瘤于37 ℃、5%CO2孵箱中培养传代，得到足够数量的肿瘤细胞，用磷酸盐缓冲液混悬，将细胞浓度调整到（4~5）×107/ml，随机取小鼠一侧大腿内侧备皮、消毒，用1 ml无菌注射器抽取0.1 ml肿瘤细胞悬液，针头挑起皮肤，将细胞悬液注入皮下。注射肿瘤细胞后约8~9 d，肿瘤最大径约1.0 cm时进行治疗。
2.治疗方法：54只荷瘤小鼠按照超声治疗时间（t）的不同随机分为6组，每组9只：A组，t=1 min；B组，t=3 min；C组，t=5 min；D组，t=7 min；E组，t=10 min；F组，不接受超声治疗（对照组）。使用1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，用量为0.01 ml/g。麻醉充分后将之仰卧位固定于操作板上，建立尾静脉通道，充分暴露肿瘤生长部位的皮肤，在肿瘤上方放置一高约2 cm的四角架，探头置于四角架之上以免压迫肿瘤，在探头与肿瘤之间用耦合剂填充以便充分耦合。二维超声模式下测量肿瘤大小，选取肿瘤最大切面，固定超声探头；经尾静脉团注0.01 ml“脂氟显”，立即用0.15 ml无菌生理盐水冲管，同时储存60 s动态造影图像。造影结束后，将一厚约2 cm的耦合垫置于四角架上，探头置于耦合垫上，使肿瘤中心距离探头约3~4 cm，切换二维超声至Vflash模式，调节ROI区域大小，使肿瘤包含在其内，并同时调节好其他固定参数开始治疗。将0.02 ml微泡用无菌生理盐水稀释至1 ml，每组在10 min内每隔1 min推注治疗微泡0.02 ml，总共推注0.1 ml以保证治疗过程中肿瘤血管内有足够的空化核。并且在治疗过程中匀速旋转探头使超声照射范围能够覆盖到整个肿瘤。微泡推注结束后待肿瘤内无明显残余微泡显影时，于肿瘤最大切面行超声造影检查并储存60 s动态造影图像。
3.超声造影定量分析：使用飞依诺VINNO70超声诊疗一体机自带的分析软件，参考二维超声图像，在造影图像上勾画出肿瘤区域，分析60 s肿瘤动态造影图像，得到时间-强度曲线。时间-强度曲线横坐标表示动态造影的时间，纵坐标表示每一帧图像的平均信号强度。软件自动计算出峰值强度（peak intensity，PI）与曲线下面积（area under curve，AUC）（图1），并计算治疗前后PI比与AUC比。计算公式为PI（AUC）比=治疗后PI（AUC）/治疗前PI（AUC）。
4.肿瘤超声造影灌注面积分析：分别截取治疗前后60 s动态造影图像中肿瘤灌注面积最大的图像，用ImageJ软件勾画出治疗前后的肿瘤区及低灌注或无灌注区，得到相应区域面积，后计算出灌注面积百分比，公式为灌注面积百分比=（肿瘤区面积-低灌注或无灌注区）/肿瘤区面积。同时计算各组治疗前后灌注面积比，计算公式为灌注面积比=治疗后灌注面积百分比/治疗前灌注面积百分比。
5.病理学检查：治疗结束后，每组随机选取2只小鼠，过量麻醉处死后立即剥出肿瘤，然后放入4%的多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片，HE染色后显微镜观察组织微结构。
6.一氧化氮含量检测：将每组剩余小鼠过量麻醉处死后立即完整剥离肿瘤，称重取样、研磨裂解、离心，取上层清液加入一氧化氮检测试剂，测量吸光度，根据标准曲线得到一氧化氮浓度。
四、统计学分析
应用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。计量资料符合正态分布的以
表示，不符合正态分布的以M（P25，P75）表示。各组PI比、AUC比、灌注面积比的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；各组一氧化氮含量比较采用Kruskal-Wallis H检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
表示，不符合正态分布的以M（P25，P75）表示。各组PI比、AUC比、灌注面积比的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；各组一氧化氮含量比较采用Kruskal-Wallis H检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果
一、超声肿瘤血流效应分析
表1 各组小鼠超声治疗前后肿瘤血流效应分析（ |
，每组n=9）| 治疗前后比值 | A组 | B组 | C组 | D组 | E组 | F组 | F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| PI比 | 1.01±0.06d | 1.03±0.09d | 1.05±0.08df | 1.13±0.07 | 1.06±0.05f | 0.97±0.05d | 4.99 | 0.001 |
| AUC比 | 1.03±0.08d | 1.05±0.12d | 1.07±0.09df | 1.15±0.06 | 1.08±0.07f | 0.99±0.05d | 4.03 | 0.004 |
| 血流灌注面积比 | 1.04±0.06cd | 1.06±0.08d | 1.12±0.11f | 1.15±0.10f | 1.11±0.09f | 0.99±0.06 | 3.99 | 0.004 |
注：PI为峰值强度；AUC为曲线下面积；A~E组分别为接受超声治疗1、3、5、7、10 min组；F组为未接受超声治疗组；与C组比较，cP<0.05；与D组比较，dP<0.05；与F组比较，fP<0.05 |
二、肿瘤组织病理表现
大体观察，各组肿瘤呈灰白色，质韧，肿瘤表面未见明显出血点，各组外观未见明显差别。低倍镜下观察肿瘤均呈低分化、侵袭性，组织致密，细胞核大、深染，呈条索状排列。各组肿瘤内未见明显渗出、水肿及新鲜出血灶。C、D、E组可见微血管扩张、充血，其中D组扩张微血管数量最多，充血最明显；C、E组微血管扩张较D组数量减少，充血程度降低；A、B组及对照组未见明显扩张充血的微血管（图3）。
三、一氧化氮检测结果。
各组肿瘤一氧化氮含量（μmol/mg）：D组［122.15（80.55，289.50）］>E组［109.00（59.30，132.30）］>C组［78.85（69.00，168.90）］>B组［73.15（61.55，115.05）］>A组［59.05（45.55，136.40）］>对照组［43.85（38.20，72.05）］。超声治疗后，肿瘤组织内一氧化氮含量较对照组增加，其中D组一氧化氮含量最高，但各组间差异无统计学意义（P>0.05，图4）。
讨论
肿瘤细胞快速增殖和肿瘤血管结构异常是实体肿瘤乏血供乏氧微环境形成的主要原因，也是产生治疗抵抗的主要原因之一［2］，因此积极探索能够增加肿瘤血流灌注，改善肿瘤缺氧的新方法对于解决肿瘤治疗抵抗十分重要。本课题组前期研究发现超声激励微泡空化可增强肿瘤血流灌注，改善肿瘤缺血，减少治疗抵抗，并对MI、PRF、脉冲长度等超声参数进行了初步探索［7-8，13-14］。本实验建立小鼠皮下MC38肿瘤模型超声可观察到肿瘤内部的缺血坏死区域，较好地模拟了恶性肿瘤的缺血缺氧状态；采用超声造影的方式来评价治疗前后肿瘤血流灌注，可实时、动态、持续地观察血流灌注变化，获得的PI、AUC、血流灌注面积可客观地评估肿瘤血流灌注［17］。
在前期研究的基础上，本实验采用了5个水平的治疗时间（1、3、5、7、10 min），以期待发现效能最优的治疗时间。实验结果表明，随着治疗时间的延长，治疗前后PI比、AUC比及灌注面积比逐渐增加，治疗5 mim及以上时，尤其是治疗7 min时，各参数均明显高于对照组。这表明要得到稳定的超声血流效应，足够的治疗时间是必须的。本课题组前期研究也显示诊断超声刺激微泡治疗5 min，丰富了兔VX2肿瘤血供［8］，低强度超声刺激微泡10 min增强了小鼠肿瘤血流灌注［13］，与本实验结果一致。虽然超声激励微泡空化时间是微秒级，但要有一定的时间积累，才有足够多的微泡发生空化并作用于血管内皮细胞，以达到血流增强的效果。而当治疗时间延长到10 min时，PI比、AUC比及灌注面积
本研究的病理结果显示，不同治疗组之间在肿瘤外观、坏死、出血方面均无明显差异。治疗时间延长而肿瘤无出血增加表明所使用的参数是安全的。治疗5 min，血管开始扩张充血，治疗7 min血管扩张充血更加明显，这与超声造影的结果吻合，也进一步证实了超声刺激微泡空化引起血管反应需要时间的积累。
本实验的局限性在于：（1）本研究仅观察了治疗后即刻的血流增强效应，未探索其效应的持续时间，下一步将进一步研究。（2）本研究仅用了超声造影一种方法评价肿瘤的血流效应，以后的实验可以采用多种方法评价肿瘤血流灌注。（3）本实验使用的参数适用于小鼠MC-38皮下移植瘤，不同动物不同肿瘤模型之间可能存在差异。
综上所述，充足且适当的超声治疗时间是超声激励微泡空化增强小鼠MC38肿瘤血流灌注的保证。超声治疗时间延长至5 min以上，肿瘤血流增强效果更加明显。其中超声治疗7 min时，肿瘤血流效应最为明显，进一步增加治疗时间对增强肿瘤血流帮助不大。其机制可能与超声激励微泡空化导致微血管扩张有关。