肝癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。其中， 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌的主要类型[2]。外科手术仍然是肝癌患者的首选治疗方式，但对于不能耐受手术或已发展至晚期的HCC 患者，局部消融治疗成为广泛应用的治疗方式。目前，肝癌常用的消融方法包含射频、微波和激光消融等。尽管上述方法各具优势，但难以避免消融过程中产生的热量，在杀伤肿瘤的同时损伤消融区域内的管道系统和神经等重要组织结构，造成严重的并发症[3-4]。因此，亟待研发更为安全有效的肿瘤消融技术。
不可逆电穿孔（irreversible electroporation，IRE）是一种新型的消融治疗方法，其通过电极之间的陡脉冲直流电作用于细胞膜，在细胞膜上形成不可逆“纳米级”孔道，从而导致细胞稳态失衡，诱导细胞凋亡[5-6]。更重要的是，IRE 选择性作用于细胞膜脂质双分子层，而构成血管、胆管和神经等的纤维骨架成分因不含脂质双分子层而得以保留[7-8]。然而，IRE 在临床应用方面仍存在一些不足，肿瘤病灶消融不彻底导致疗效不足以及肌肉收缩对术中安全性的影响仍然是IRE 技术推广面临的主要挑战[9-10]。为解决这些问题，本团队前期研发了纳秒脉冲电场（nanosecond pulsed electric fields，nsPEFs），并评估了nsPEF 在无法进行热消融的高危HCC 患者中的疗效和安全性，其超短的纳秒级高压脉冲显著减少了焦耳热的累积，有着更轻微的肌肉收缩，同时保持了良好的消融效果[11]。但是有研究显示nsPEFs 消融的长期有效性仍存在较大的提升空间[12]。
本研究在nsPEFs 的基础上，研发了微纳秒脉冲电场（microsecond-nanosecond pulsed electric fields，μs-nsPEFs）消融新技术，并将其应用于猪肝组织消融。首先在术前借助3D 仿真软件预先模拟电场分布。然后采用超声引导下开腹消融手术，借助针式电极对白猪肝组织分别释放μs-nsPEFs 和nsPEFs 电脉冲，术中记录白猪的肌肉收缩情况，并在术后10 min 通过超声造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）评估消融范围。术后第7 天通过实验室检查和组织病理学表现评估消融的效果。本研究旨在探索μs-nsPEFs 技术应用于白猪肝脏的有效性和安全性，为其未来的临床应用提供参考。
材料与方法
一、实验动物
选用4 头雌性白猪，体重40 ~ 50 kg，将其随机分为μs-nsPEFs 组2 头和nsPEFs 组2 头，μsnsPEFs 组编号为P01、P02，nsPEFs 组编号为P03、P04。白猪由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，采购自江苏省泰州泰和生物科技有限公司。所有白猪在控制12 h 光照和12 h 黑暗循环的室内，并在20 ~ 22℃的温度条件下饲养1 周。本研究的动物实验经过浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会审核（实验动物伦理批准编号：IACUC-20220425-08）。
二、实验设备及参数
本研究电场消融实验使用浙江大学医学院附属第一医院和Curaway 医疗技术公司（中国）共同研发的集成式消融平台设备和电极针（图1a）。本研究行超声引导的设备为迈瑞M9 便携式彩色多普勒超声仪，探头型号为c5-1s 和L12-4S。其中，电场消融的电极为19G 实心不锈钢单极电极针，电极针尖裸露端长度为1.5 cm（图1b、1c）。电场消融实验设置参数如下：nsPEFs 组电压为12000 V，脉宽为400 ns，脉冲间隔为1 s，脉冲共计180 次（图1e）；μs-nsPEFs 组微秒电压为4000 V，脉宽为4 μs，纳秒电压为12 000 V，脉宽为400 ns，纳秒与微秒脉冲内部间隔为1 μs，与下个微纳秒脉冲间隔为1 s，共计180 次（图1f）。
三、3D 仿真模拟电场分布
为了评估电场消融术中的电场分布，使用了COMSOL 6.0 有限元软件分别建立白猪μs-nsPEFs与nsPEFs 电场分布的耦合模型，仿真模型采用球形网格划分，所有区域边界均设置为电绝缘，电场强度通过相互平行的正负电极向外施加，电极间的距离为2 cm。仿真实验采用与人体肝脏组织相同的电导率（2.77E-02 sm-1）和相对介电常数（1.51×107）[13]。
四、电场消融处理
所有实验白猪在术前12 h 禁食、禁水。白猪通过静脉注射丙泊酚实施麻醉，待其镇静后转运至手术台，取仰卧位，并连接吸入式麻醉系统和心电监护仪。对白猪腹部进行剃毛、碘伏消毒，随后铺设洞巾，打开腹部暴露肝脏。碘伏消毒电极针，并预先检测放电能力。在超声引导下，双针电极沿垂直于肝脏表面的方向插入肝脏进行消融，两根针保持平行，距离通过卡尺控制在2 cm（图1d）。接着按照所设置参数进行放电，每组消融分别在白猪肝脏的左外叶、左内叶、右内叶重复3 次，共计12次。术后10 min 通过CEUS 评估消融灶的情况，并记录造影面积。使用测振仪记录肌肉收缩距离。放电完成后，移除电极针并进行腹部缝合，同时注射抗生素预防术后感染，待白猪苏醒，将其转移至无菌动物实验房继续饲养和护理，并于术后隔天注射抗生素预防感染。术后第7 天，对白猪进行开腹超声检查，随后进行取材。
五、实验室检查
在消融术前2 h、术后2 h 及术后第7 天，于白猪颈部采集血液进行血清肝肾生化相关指标分析和电解质水平检测，包括天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、尿素（urea，UREA）、肌酐（creatinine，CREA）、钾（kalium，K）、钠（sodium，Na）等。
六、病理学检查
在IRE 术后的第7 天，以安乐死的方式处死4 只白猪，取出消融区肝脏组织和胆囊壁组织浸泡在4%多聚甲醛中制成组织样本。组织样本经过石蜡包埋处理后，按照与电极针道垂直的方向连续切割5 ~ 10 张，切片厚度为4 μm。选择1 ~ 2 张组织完整、薄厚均匀、平坦且无刀痕、裂隙或褶皱的切片，进行HE 染色，并在显微镜下观察消融效果。
七、统计学分析
本研究的数据分析使用GraphPad Prism 8.2.0软件进行。对于计量资料，结果以
±s 表示，组间比较采用Student’s t 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。CEUS 造影图像和3D 仿真电场分布图像通过Image J 软件进行勾画和分析消融面积。
±s 表示，组间比较采用Student’s t 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。CEUS 造影图像和3D 仿真电场分布图像通过Image J 软件进行勾画和分析消融面积。结 果
一、3D 仿真模拟电场分布
二、超声引导下肝脏消融
在超声引导下，所有开腹肝脏消融手术均顺利完成，消融过程中，白猪均可观察到肌肉收缩。术后所有白猪均存活，未发现明显并发症。术后10 min CEUS 图像清晰显示了μs-nsPEFs 和nsPEFs消融区域。nsPEFs 组术后10 min 勾画的消融面积约为（4.33±1.55） cm2；μs-nsPEFs 组术后10 min勾画的消融面积约为（4.70±1.62）cm2。统计分析显示，μs-nsPEFs 组与nsPEFs 组术后10 min CEUS造影面积差异无统计学意义（P＞0.05）。术后第7天超声探查结果显示，μs-nsPEFs 组胆囊呈椭圆形，胆囊壁回声均匀，腔内无回声；胆囊旁肝脏消融区域存在数个圆形或不规则形、边界模糊的低回声区域，而nsPEFs 组未发现明显的低回声区域（图3）。电场消融术中通过测振仪监测肌肉收缩距离，根据μs-nsPEFs 组与nsPEFs 组消融过程中的肌肉收缩距离进行独立样本t 检验，两组肌肉收缩距离差异无统计学意义（P＞0.05）。
三、肝脏病理表现
四、实验室指标变化
为评估μs-nsPEFs 对机体电解质稳态及肝肾功能的影响，本研究通过手术前后多次采血检测了μs-nsPEFs 组P01 号白猪的血清电解质和肝肾生化指标（表1）。电场消融术前2 h 采集的血液样本各项指标均正常；电场消融术后2 h 采集的血液样本显示，电解质处于正常水平范围内，而AST、ALT及UREA 水平相较术前2 h 结果有明显升高，提示机体瞬时有轻微的肝功能损伤；术后第7 天的血清生化检测显示AST、ALT 和UREA 水平已恢复至正常范围。
表1 μs-nsPEFs 消融前后P01 号白猪血清电解质及肝肾生化指标分析 |
| 电解质及生化指标 | 术前2h | 术后2h | 术后7d |
|---|---|---|---|
| 天门冬氨酸氨基转移酶（U/L） | 36.00 | 88.00 | 29.20 |
| 丙氨酸氨基转移酶（U/L） | 77.60 | 99.30 | 68.20 |
| 白蛋白（g/L） | 39.16 | 37.97 | 35.28 |
| 总蛋白（g/L） | 60.11 | 67.63 | 64.97 |
| 球蛋白（g/L） | 29.82 | 29.66 | 29.69 |
| 碱性磷酸酶（U/L） | 77.70 | 78.20 | 58.90 |
| 胆固醇（mmol/L） | 1.69 | 1.42 | 1.77 |
| 肌酐（μmol/L） | 106.10 | 110.50 | 106.40 |
| 谷氨酰转肽酶（U/L） | 35.10 | 41.00 | 36.70 |
| 葡萄糖（mmol/L） | 5.99 | 4.77 | 5.13 |
| 总胆红素（μmol/L） | 1.22 | 1.30 | 1.20 |
| 甘油三酯（mmol/L） | 0.25 | 0.60 | 0.22 |
| 尿素（mmol/L） | 3.37 | 8.23 | 3.46 |
| 钙（mmol/L） | 2.33 | 2.37 | 2.29 |
| 无机磷（μmol/L） | 1.99 | 1.98 | 1.96 |
| 钾（mmol/L） | 4.53 | 4.33 | 4.49 |
| 钠（mmol/L） | 144.50 | 141.70 | 141.20 |
| 氯（mmol/L） | 98.20 | 97.80 | 98.90 |
讨 论
IRE 作为新兴的物理消融技术，通过不可逆电穿孔诱导细胞凋亡的方式杀伤肿瘤细胞，但一直面临着消融手术安全性与长期有效性不足的问题[15]。nsPEFs 技术的出现，使得IRE 的安全性大大提升，但超短频高压的电脉冲使其在消融长期疗效方面面临挑战[16-17]。因此，本研究开发了μs-nsPEFs 消融新技术。与nsPEFs 技术相比，μs-nsPEFs 设备的优势在于增加微秒级脉冲波形，形成微纳秒复合脉冲，在保证手术安全性的前提下，实现了更长久有效的消融效果。
本研究采用μs-nsPEFs 技术成功消融实验白猪在体肝组织，超声探查显示消融结束后第7 天消融区域毗邻的胆囊壁回声信号正常，无明显损伤。2015 年Alexander 等[18]的研究表明，细胞在大血管结构附近的存活可能是由这些区域产生的“electric field sinks”造成的电场分布不均，其中位于“electric field sinks”中的细胞仅仅暴露在均匀器官平均电场强度的40%以下，这或许解释了IRE 对邻近脉管结构的保护作用。随后，Martina 等[19]对IRE 应用于位于肝静脉或者门静脉附近肝癌的有效性与安全性进行研究，得出IRE 有助于避免继发于热沉效应和主要血管损伤的不完全消融的结论。本课题组在2017 年也对IRE 应用于位于肝静脉或者门静脉附近肝癌的有效性与安全性进行研究，结果表明IRE 可以在不损伤门静脉的情况下提供安全有效的短期肿瘤消融效果[20]。上述研究合理地解释了IRE 不容易对以纤维结构为主的血管、胆囊等组织造成损伤的原因，这也为μs-nsPEFs 技术在肝脏消融术中的安全性提供了重要保障。
本研究通过3D 仿真电场模拟μs-nsPEFs 与nsPEFs 在肝组织中场强分布的情况，根据3D 仿真电场分布估算的消融面积作为理论预测值，为IRE 消融作用模式提供依据[21]。随后超声引导下的μs-nsPEFs 与nsPEFs 消融结果显示，μs-nsPEFs与nsPEFs 术后10 min 的CEUS 造影测量面积差异无统计学意义（P＞0.05），说明从CEUS 角度评估，两组参数的短期消融效果无明显差别；但术后第7 天的超声探查中，μs-nsPEFs 组发现了残余IRE消融病灶，而nsPEFs 组没有发现残余消融病灶，HE 染色观察到μs-nsPEFs 组标本测量消融面积为（0.15±0.08 ）cm2，且未在nsPEFs 组切片中观察到消融区，结果与超声扫查结果相符。超声扫查与病理结果共同验证了μs-nsPEFs 相较于nsPEFs 有着更为持久的消融效果。另外，μs-nsPEFs 组HE染色切片中消融区中央圆形的大范围液化性坏死灶，提示着μs-nsPEFs 可能导致了肝脏组织的热损伤，这种情况已被报道[22]，但还需要更深入的研究加以证实。
为了研究局部肌肉收缩对IRE 治疗的影响，本研究利用测振仪记录术中肌肉收缩距离。独立样本t 检验结果显示，nsPEFs 组与μs-nsPEFs 组的术中肌肉收缩距离差异无统计学意义。nsPEFs 具备较强的术中抑制肌肉收缩的能力[11，23-24]，本研究结果证明了μs-nsPEFs 在术中也可以有效控制肌肉收缩。本研究还通过实验室检查进一步验证了μsnsPEFs 在维持正常机体的电解质平衡及肝肾功能方面的安全性。虽然μs-nsPEFs 术后2 h 生化分析提示轻微肝损伤，但在术后第7 天已完全恢复正常，这表明μs-nsPEFs 在维持机体稳态方面同样具备保障。
μs-nsPEFs 技术为肝癌IRE 消融治疗提供了全新的解决方案，在保证术中安全性的前提下，实现了较nsPEFs 更为持久有效的肝脏消融效果，在肝癌消融领域具有良好的临床应用前景。本研究尚存在一些局限性：（1）尽管μs-nsPEFs IRE 技术在肿瘤治疗中已经展现出一定优势，但其在电场分布不均匀和肿瘤组织异质性上的局限性本文缺乏相关探讨[25-26]；（2）本研究在正常猪肝组织中进行，未在肝脏肿瘤模型中进一步验证消融效果；（3）实验样本量较少，可能导致实验结果不稳定。
综上所述，本研究表明，μs-nsPEFs 通过释放微纳秒脉冲电场，在术后短期造影中表现出与nsPEFs 技术近似的结果，且在术后第7 天展现出持久有效的消融效果。此外，μs-nsPEFs 技术能有效控制术中肌肉收缩，且对消融灶周围的胆囊有着较好的保护能力。