低强度超声缓解顺铂所致小鼠卵巢损伤的实验研究

doi:10.3877/cma.j.issn.1672-6448.2024.12.006

目的

探讨低强度脉冲超声（LIPUS）对顺铂所致小鼠卵巢细胞损伤的缓解作用。

方法

将40 只ICR 小鼠分为对照组（n=12）、顺铂组（n=14）、顺铂+LIPUS 组（n=14），对照组小鼠腹腔注射生理盐水，顺铂组小鼠腹腔注射顺铂，顺铂+LIPUS 组小鼠腹腔顺铂注射、次日LIPUS 照射，周期共2 周。取小鼠卵巢行HE 染色、RNA 测序、免疫组化、TUNEL 染色、蛋白质免疫印迹（western blot）及实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR），进行卵泡计数，检测卵巢中凋亡、铁死亡及氧化应激等细胞生理事件相应细胞因子表达水平。

结果

与对照组相比，顺铂组卵巢体积缩小；与顺铂组相比，顺铂+LIPUS 组小鼠的卵巢体积增大。对照组、顺铂组与顺铂+LIPUS 组的卵巢重量比较[（8.8±1.34）mg vs （2.8±0.45）mg vs （5.6±1.35）mg]，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比，顺铂组原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡及有腔卵泡的数目减少；与顺铂组相比，顺铂+LIPUS 组相应各级卵泡数目增多（P＜0.05）。LIPUS 治疗与否差异基因主要富集在细胞生理水平事件上，如细胞凋亡、铁死亡及氧化应激方面。与对照组相比，顺铂组Bax、p-H2AX、TUNEL 信号、3-Nit、4-HNE 及8-OHdG 表达增加，Bcl2、SIRT1、SIRT2、Nrf2、FPN、GPX4、Fth、Ftl 等因子表达减少（P＜0.05）；与顺铂组相比，顺铂+LIPUS 组Bax、p-H2AX、TUNEL 信号、3-Nit、4-HNE 及8-OHdG 表达减少，Bcl2 及铁死亡相应各因子除SIRT2 外表达均增加（P＜0.05）。

结论

LIPUS 可以缓解顺铂所致小鼠卵巢损伤，其机制可能是通过调控凋亡、铁死亡及氧化应激细胞因子的表达。

关键词: 低强度超声, 卵巢, 顺铂, 凋亡, 铁死亡, 氧化应激, 小鼠

Objective

To investigate the repairing effect of low-intensity ultrasound (LIPUS)on cisplatin-induced ovarian cell damage in mice.

Methods

Forty ICR mice were divided into a control group (n=12), a cisplatin group (n=14), and a cisplatin+LIPUS group (n=14).Control mice were injected intraperitoneally with saline, mice in the cisplatin group were injected intraperitoneally with cisplatin, and the cisplatin+LIPUS group underwent intraperitoneal cisplatin injection, followed by LIPUS irradiation on the next day.The treatment cycle was 2 weeks long.Mouse ovary tissues were taken for HE staining for follicle counting.RNA sequencing, immunohistochemistry, TUNEL staining, protein immunoblotting (Western blot), and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qPCR) were performed to detect the expression of cytokines in different cellular physiological events in the ovaries such as apoptosis, iron death,and oxidative stress.

Results

Compared to the control group, ovarian size was reduced in the cisplatin group; compared to the cisplatin group, ovary size was increased in the cisplatin+LIPUS group.Comparison of ovarian weights in the control, cisplatin, and cisplatin+LIPUS groups (8.8±1.34 vs 2.8±0.45 vs 5.6±1.35)revealed statistically significant differences (P＜0.05).Compared to the control group, the number of primordial follicles, primary follicles, secondary follicles and antral follicles was reduced in the cisplatin group; compared with the cisplatin group, the number of follicles at the corresponding levels was increased in the cisplatin+LIPUS group (P＜0.05).Between mice with LIPUS treatment and controls, differential genes were mainly enriched in events at the cellular physiological level, such as apoptosis, iron death, and oxidative stress.Compared to the control group, Bax, p-H2AX, TUNEL signal, 3-Nit, 4-HNE, and 8-OHdG levels were increased, while the levels of factors such as Bcl2, SIRT1, SIRT2, Nrf2, FPN, GPX4, Fth, and Ftl were reduced in the cisplatin group (P＜0.05); compared with the cisplatin group, the levels of Bax,p-H2AX, TUNEL signal, 3-Nit, 4-HNE, and 8-OHdG were reduced, while the levels of Bcl2 and iron death factors except SIRT2 were increased (P＜0.05).

Conclusion

LIPUS can alleviate cisplatin-induced ovarian damage in mice, possibly by regulating apoptosis, iron death, and oxidative stress.

Key words: Low-intensity ultrasound, Ovary, Cisplatin, Apoptosis, Iron death, Oxidative stress, Mice

图1 小鼠造模实验流程图注：LIPUS 为低强度脉冲超声；Day1 ～Day14 为第1 ～14 天

表1 小鼠卵巢组织引物序列

基因名	正向序列（5'→3'）	反向序列（3'→5'）
SIRT1	GCTGACGACTTCGACGACG	TCGGTCAACAGGAGGTTGTCT
SIRT2	GCCTGGGTTCCCAAAAGGAG	GAGCGGAAGTCAGGGATACC
Nrf2	AGTGACTCGGAAATGGAGGAG	TGTGCTGGCTGTGCTTTAGG
FPN	GTGGAGTACTTCTTGCTCTGG	CTGCTTCAGTTCTGACTCCTC
GPX4	GATGGAGCCCATTCCTGAACC	CCCTGTACTTATCCAGGCAGA
Fth	CCATCAACCGCCAGATCAAC	GAAACATCATCTCCGTCAAA
Ft1	CGTCTCCTCGAGTTTCAGAAC	CTCCTGGGTTTTACCCCATTC

表1 小鼠卵巢组织引物序列

基因名	正向序列（5'→3'）	反向序列（3'→5'）
SIRT1	GCTGACGACTTCGACGACG	TCGGTCAACAGGAGGTTGTCT
SIRT2	GCCTGGGTTCCCAAAAGGAG	GAGCGGAAGTCAGGGATACC
Nrf2	AGTGACTCGGAAATGGAGGAG	TGTGCTGGCTGTGCTTTAGG
FPN	GTGGAGTACTTCTTGCTCTGG	CTGCTTCAGTTCTGACTCCTC
GPX4	GATGGAGCCCATTCCTGAACC	CCCTGTACTTATCCAGGCAGA
Fth	CCATCAACCGCCAGATCAAC	GAAACATCATCTCCGTCAAA
Ft1	CGTCTCCTCGAGTTTCAGAAC	CTCCTGGGTTTTACCCCATTC

图2 各组小鼠卵巢体积大小比较及卵巢重量定量分析图。图a 示对照组、顺铂组及顺铂+低强度脉冲超声（LIPUS）组卵巢大小；图b 为对照组、顺铂组及顺铂+LIPUS 组卵巢重量定量分析柱状图（*表示P＜0.05；****表示P＜0.0001）注：LIPUS 为低强度脉冲超声

表2 不同组别小鼠各级卵泡计数比较（±s ）

组别	数量（只）	原始卵泡	初级卵泡	次级卵泡	有腔卵泡
对照组	6	15.50±3.14	16.50±7.01	63.83±6.94	5.33±2.25
顺铂组	6	3.67±1.63^a	2.50±1.76^a	14.83±5.74^a	1.00±0.63^a
顺铂+LIPUS组	6	14.00±4.10^b	20.00±5.14^b	66.33±16.08^b	3.33±1.86^b
P值		＜0.0001	＜0.0001	0.011	0.015

表2 不同组别小鼠各级卵泡计数比较（±s ）

组别	数量（只）	原始卵泡	初级卵泡	次级卵泡	有腔卵泡
对照组	6	15.50±3.14	16.50±7.01	63.83±6.94	5.33±2.25
顺铂组	6	3.67±1.63^a	2.50±1.76^a	14.83±5.74^a	1.00±0.63^a
顺铂+LIPUS组	6	14.00±4.10^b	20.00±5.14^b	66.33±16.08^b	3.33±1.86^b
P值		＜0.0001	＜0.0001	0.011	0.015

图3 各组小鼠卵巢HE 染色图像。图a ～c 分别为对照组、顺铂组及顺铂+LIPUS 组卵巢HE 染色图像（×50）；图d ～f 分别为3 组卵巢HE 染色图像（×100）；图g ～i 分别为3 组卵巢HE 染色图像（×200）（箭头所示为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡及有腔卵泡）注：LIPUS 为低强度脉冲超声

图4 三组小鼠的转录组测序及生物信息学分析图。图a，b 分别为顺铂组与对照组、顺铂组与顺铂+LIPUS 组差异基因KEGG 富集散点图（纵轴表示通路名称，横轴表示富集因子，点的大小表示此通路中差异表达基因个数多少，而点的颜色对应于不同的Q 值范围）；图c，d 分别为顺铂组与对照组、顺铂组与顺铂+LIPUS 组显著富集KEGG 注释分类条形图（纵轴表示通路名称，横轴表示基因个数）注：LIPUS 为低强度脉冲超声

图5 各组小鼠卵巢组织Bax、Bcl2 因子表达的免疫组化图像（×200）。图a ～c 分别为对照组、顺铂组及顺铂+LIPUS 组卵巢组织Bax 因子表达免疫组化图像；图d ～f 分别为3 组卵巢组织Bcl2 因子表达免疫组化图像注：LIPUS 为低强度脉冲超声

图6 各组小鼠卵巢组织Bax、Bcl2 因子定量分析图。图a 为对照组、顺铂组及顺铂+LIPUS 组卵巢组织Bax 因子定量分析柱状图；图b 为3 组卵巢组织Bcl2 因子定量分析柱状图（*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001）注：LIPUS 为低强度脉冲超声

图7 各组小鼠卵巢组织细胞凋亡相关因子表达的Western blot 图像及定量分析图。图a 为对照组、顺铂组及顺铂+LIPUS 组小鼠卵巢组织p-H2AX、Bax、GAPDH 因子表达的Western blot 图像；图b，c 分别为3 组p-H2AX/GAPDH、Bax/GAPDH 因子表达的定量分析柱状图（*表示P＜0.05；**表示P＜0.01）注：LIPUS 为低强度脉冲超声

图8 各组小鼠卵巢细胞凋亡情况TUNEL 染色图像。图a ～c 分别为对照组、顺铂组及顺铂+LIPUS 组TUNEL 染色图像；图d ～f 分别为3 组细胞核染色图像；图g ～i 分别为3 组TUNEL 及DAPI 染色合成图像注：LIPUS 为低强度脉冲超声

图9 各组小鼠卵巢细胞凋亡的定量分析柱状图（**表示P＜0.01；***表示P＜0.001）注：LIPUS 为低强度脉冲超声

图10 各组小鼠卵巢组织铁死亡相关因子m-RNA 相对表达水平柱状图。图a ～g 分别为对照组、顺铂组及顺铂+LIPUS组卵巢组织SIRT1、Nrf2、GPX4、SIRT2、FPN、Fth 及Ftl 因子mRNA 相对表达水平的定量分析柱状图（*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001；****表示P＜0.0001）注：LIPUS 为低强度脉冲超声

图11 各组小鼠卵巢组织相应氧化应激因子表达的免疫组化图像（×200）及定量分析图。图a ～c 为对照组、顺铂组及顺铂+LIPUS 组3-Nit 因子表达的免疫组化图像；图d ～f 为3 组4-HNE 因子表达的免疫组化图像；图g ～i 为3 组8-OHdG 因子表达的免疫组化图像；图j ～l 分别为3 组3-Nit、4-HNE 及8-OHdG 的定量分析柱状图（**表示P＜0.01；***表示P＜0.001；****表示P＜0.0001）注：LIPUS 为低强度脉冲超声

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